本節集中處理基因工程、蛋白質分析、基因編輯三大類技術。PCR、Sanger 定序、ASO / siRNA 已在第七、八章深入；這裡補齊其他核心技術。 11.6.1　限制酶（restriction enzymes） 特性： 細菌防禦系統的一部分（配合 methylase 區分自家 vs 外來 DNA） Type II 是分子生物學最常用：辨識 4–6 bp 的迴文序列（palindromic sequence）+ 切 DNA + 不需甲基化差異 切口可為黏端（sticky end） 或 鈍端（blunt end） 迴文序列（palindromic sequence）：5'→3' 讀與 3'→5' 讀（對應另一股）序列相同。判定要點： 以 6 bp 例：5'-GAATTC-3' / 3'-CTTAAG-5' → 互補對齊讀都是 GAATTC → 迴文（EcoRI 位點） 反例：5'-CATTAG-3' / 3'-GTAATC-5' → 把下股反向互補讀成 CTAATG，與 CATTAG 不同 → 非迴文 國考： • 「第二型限制酶辨識序列大小？」= 4–6 bp。 • 「下列何者是迴文序列？」 • 「RNA 聚合酶、反轉錄酶、PNK 不能做 DNA 重組切接」= 重組切 DNA 用 限制酶 + ligase。 11.6.2　DNA 選殖（cloning）與質體（plasmid） 選殖質體（cloning plasmid）必要元素： 複製起點（origin of replication, ori）：在宿主內能複製的根本 抗生素抗藥性基因（selection marker）：篩選成功轉形的菌落 多選殖位（MCS, multiple cloning site）：多個限制酶切位叢集 啟動子（如果要表達蛋白質） DNA 選殖流程： 限制酶切載體 + 目的 DNA → 產生相容黏端 DNA ligase 接合 → 重組質體 轉形入大腸桿菌 → 抗生素篩選 → 挑選 colony 國考： • 「兩個質體上 DNA 片段重組，最可能用何酵素？」= 限制酶（搭配 DNA ligase）；選項中 RNA pol、RT、PNK 都不對。 • 「選殖質體必須有抗生素抗性基因」= 正確；不需 Cre recombinase；必須有 ori；一般 plasmid 只能接 ~10 kb 以內（> 50 kb 要改用 cosmid、BAC、YAC）。 • 「建立人類 genomic library，不需反轉錄酶」正確（genomic library 直接從基因體 DNA 切片，不走 RNA）；cDNA library 才需要 RT（mRNA → cDNA）。 11.6.3　轉形（transformation）與轉染（transfection） Transformation（轉形）：外源 DNA 進入細菌 常用：CaCl₂ + heat shock（經典方法） 替代：electroporation（電穿孔）、natural competence（如肺炎鏈球菌） Transfection（轉染）：外源 DNA 進入真核細胞 化學法：脂質體（lipofection）、磷酸鈣共沉 物理：電穿孔、microinjection 生物：病毒載體（adenovirus、lentivirus、AAV） Transduction（轉導）：噬菌體把 DNA 帶入細菌 國考：「質體轉形入細菌的最常用方法？」= CaCl₂ + heat shock（低電壓電泳、microinjection、噬菌體轉染都不是「最常用」）。 11.6.4　Genomic library vs cDNA library 項目 Genomic library cDNA library 來源 基因體 DNA 切片 mRNA → RT → cDNA 包含 intron ✅ ❌（mRNA 已剪接） 代表組織特異性 否（所有細胞同樣基因體） 是（反映該組織的基因表達） 需要反轉錄酶？ ❌ ✅ 用途 研究基因組結構、intron/exon、promoter 研究表達蛋白、抗體庫、製備重組蛋白 11.6.5　PCR 與 Sanger 定序（簡短回顧，詳見第七章） PCR 反應混合物：模板 DNA、一對引子、Taq polymerase（熱穩定）、dNTPs、Mg²⁺、緩衝液 PCR 不需 ATP（能量來自 dNTP 水解；ATP 只在細胞中連接酶等需要，PCR 本身不加） Sanger 定序關鍵：2',3'-dideoxyNTP（ddNTP）鏈終止法 國考：「PCR 不需加什麼？」= ATP（其他 DNA pol、dNTPs、Mg²⁺ 都需要）。 11.6.6　qPCR / RT-qPCR（即時定量 PCR） qPCR：在 PCR 過程即時測量產物，可量化原始模板濃度。 偵測化學 原理 特異性 SYBR Green 嵌入雙股 DNA 後發螢光 不專一，任何雙股 DNA 都會亮（含 primer-dimer）；需配 melting curve 確認 TaqMan probe 探針兩端有 fluorophore 與 quencher，DNA pol 5'→3' 外切活性把探針切斷 → fluorophore 釋出發光 高度專一，只有對到目標序列的探針才被切 RT-qPCR：先以反轉錄酶把 mRNA 變 cDNA，再 qPCR，量化基因表達。COVID-19 的 PCR 檢測就是 RT-qPCR。 記憶法：「qPCR 量 DNA、RT-qPCR 量 RNA」。臨床「PCR 檢測 SARS-CoV-2」實際是 RT-qPCR（因為病毒基因體是 RNA）。 11.6.7　次世代定序（Next-Generation Sequencing, NGS） 突破 Sanger 一次只能跑一條的瓶頸，同時並行 10⁶–10⁹ 條 DNA 定序。 平台 化學 特色 Illumina（主流） Sequencing by synthesis：可逆終止 + 螢光標記 dNTP，每個循環讀一個 base 短讀（150–300 bp）、高準確度、低成本／base Oxford Nanopore 把 DNA 拉過奈米孔，即時測電流變化 超長讀（> 100 kb）、可即時、可測 RNA 與 PTM；錯誤率較高 PacBio HiFi SMRT + circular consensus 長讀（10–30 kb）、高準確度 臨床用途： 全外顯子定序（WES）、全基因體定序（WGS） → 罕病、癌症基因分析 液態生檢（liquid biopsy） → 血漿 cfDNA 偵測癌症突變 微生物：直接從檢體做 metagenomic NGS 找致病菌 新冠病毒變異株監測 11.6.8　FISH 與染色體核型分析 技術 原理 用途 Karyotype（染色體核型） 中期細胞、染色（Giemsa banding）後顯微鏡看染色體 數目異常（Trisomy 21、Turner、Klinefelter）、大片段易位（CML 的 t(9;22) Philadelphia） FISH（Fluorescence in situ hybridization） 螢光標記 DNA probe 直接雜交到固定細胞或染色體上 點突變不能查；微缺失（DiGeorge 22q11.2、Williams 7q11）、HER2 amplification、BCR-ABL 融合可查；解析度 100 kb–10 Mb aCGH（array CGH）、SNP array 微陣列比對 全染色體解析的微缺失/微重複 11.6.9　CRISPR 2.0：base editor 與 prime editor CRISPR-Cas9（§11.9.1）會切雙股 → 細胞修復不可預期；第二代基因編輯改採「不切 DNA、直接化學改鹼基」： 技術 機制 可改的變化 Base editor（鹼基編輯器） Cas9 nickase（只切單股）+ 去胺酶融合 C→T（cytosine base editor, CBE）、A→G（adenine base editor, ABE）；單一鹼基精準修改 Prime editor（引導編輯器） Cas9 nickase + 反轉錄酶 + pegRNA（含目標序列模板） 任意鹼基替換、小段插入/缺失（< 100 bp） 由 David Liu 實驗室開發（CBE 2016、ABE 2017；Prime editor 2019） 優勢：不需要 DSB → 不易誤插入、不易染色體易位 臨床試驗：Casgevy / Lyfgenia（2023 年 FDA 核准的 sickle cell disease 與 β-thalassemia CRISPR 治療，技術上是 ex vivo Cas9，但 base editor 版本已在試驗中）