蛋白質純化

核心邏輯

蛋白質純化的原則只有一句話：利用蛋白質之間某個物理化學性質的差異，把目標蛋白從混合物中分離出來。

五大可利用的差異：

1. 溶解度（鹽析）
2. 大小（膠體過濾、超離心、透析）
3. 電荷（離子交換層析、等電聚焦、電泳）
4. 專一性結合（親和層析、免疫沉澱）
5. 疏水性（疏水相互作用層析）

實務上一個蛋白質純化流程常是「粗→中→精」：先用鹽析粗分、再用離子交換中分、最後用親和層析精純。

膠體過濾層析（gel filtration / size-exclusion chromatography, SEC）

管柱裡填滿多孔膠珠（像瑞士起司）：

• 大分子：鑽不進小孔，只能沿珠子外面流，路徑短，先流出
• 小分子：可以鑽進珠子內部的小孔，路徑長，後流出

這個技術依分子大小分離，很適合脫鹽或估分子量（配合標準品校正曲線）。

離子交換層析（ion-exchange chromatography）

膠珠表面帶正電（陰離子交換劑，attracts anions）或帶負電（陽離子交換劑），帶相反電荷的蛋白質會被吸附，然後逐步升高鹽濃度把蛋白質一個個洗出來，電荷越強的蛋白越晚出來。

親和層析（affinity chromatography）：專一性最強

在膠珠上接一個能專一結合目標蛋白的配體（substrate、抑制劑、抗體、特殊標籤）。混合物通過管柱時，只有目標蛋白被抓住，其他通通流掉；然後用競爭性配體或改變條件把目標蛋白洗下來。

重組蛋白常用的親和標籤（affinity tags）：

所以遺傳工程上做融合蛋白時，常會在 N 端或 C 端加一段 (His)₆ 標籤，下游純化就用 Ni²⁺-NTA 一次完成。

等電聚焦（IEF）+ SDS-PAGE

• 等電聚焦：在一個 pH 梯度的凝膠上電泳，每個蛋白會遷移到它自己的 pI 處停住。依 pI 分離。
• SDS-PAGE：SDS 把蛋白變性成棒狀、同時賦予均勻負電（與質量成正比）；在凝膠中電泳依分子量分離（大分子被網孔阻礙，跑得慢）。
• 二維電泳（2-D）：先 IEF 再 SDS-PAGE：兩個維度都分離一次，能看出成千上萬個蛋白。

為什麼 SDS 很關鍵？

SDS（十二烷基硫酸鈉）是強力的陰離子界面活性劑：

1. 打斷疏水核心：非離子性的疏水交互作用、氫鍵都被破壞，蛋白質從球狀攤開成棒狀。
2. 均勻負電荷：SDS 依質量比例裹覆蛋白質（約 1.4 g SDS / g 蛋白），讓每個蛋白帶上幾乎成比例的負電，抹平電荷差異，只剩大小決定遷移速度。
3. 不破壞肽鍵、不破壞雙硫鍵：要完全變性得加 β-ME。

蛋白質–蛋白質交互作用（PPI）的偵測

分析技術

放射免疫分析（radioimmunoassay, RIA）

RIA 是競爭型免疫分析。反應中加入固定量、有限量的專一性抗體，以及固定量的放射標記抗原（tracer）；檢體中的未標記抗原與 tracer 競爭相同的抗體結合位。

反應達平衡後，分離抗體結合相與游離相，再測量抗體結合相中的 tracer 放射活性：

• 檢體抗原越多，競爭越強，tracer 就搶不到抗體，抗體-抗原結合相的放射訊號就越低。

三明治酵素連結免疫吸附分析（Sandwich ELISA principle）

用兩種專一性抗體「夾住」目標抗原，形似三明治：

1. 捕捉抗體（Capture Antibody）：預先固定在固態載體（如微孔盤或試紙）上，用來抓取檢體中的目標抗原。
2. 目標抗原（Target Antigen）：檢體中的待測物，與捕捉抗體結合。
3. 檢測抗體（Detection Antibody）：隨後加入的第二種抗體，能結合抗原的另一端。此抗體通常標記有酵素或螢光物質，用於後續呈色與判讀。

• 訊號越強代表抗原越多，高專一、高靈敏度，應用廣（快篩等等）。