8.9.1　PCR（Polymerase Chain Reaction）

PCR 三步驟循環：94–95 °C 變性 → 50–65 °C 退火 → 72 °C 延伸。

原理：以一對特定 primer 指定擴增片段的 5' 與 3' 邊界，經變性 / 退火 / 延伸循環，20–35 cycles 後目標片段指數放大。

為何用 Taq polymerase 不用 E. coli pol III？

• E. coli 的 DNA pol 在 95 °C 會變性失活（熱穩定性差）
• Taq polymerase（來自 Thermus aquaticus）在 72 °C 最佳活性、95 °C 不失活

國考考點：

• 單對 primer → 僅擴增單一位點（多位點擴增需多對 primer，稱 multiplex PCR）
• 擴增片段長度由一對 primer 在模板上的相對位置決定
• 一根毛髮的毛囊即有足夠 DNA 做 PCR

8.9.2　Sanger 定序（dideoxy method）

Sanger 定序：摻入 2',3'-dideoxyNTP（ddNTP），因無 3'-OH 導致鏈終止，以不同螢光標記四種 ddNTP。

• 關鍵分子：2',3'-dideoxyribonucleotides（ddNTPs）
• ddNTP 缺 3'-OH → 被摻入後鏈終止
• 四種 ddNTP（A/T/C/G）分別標記不同螢光 → 毛細管電泳讀序

8.9.3　5' 端標記：γ-P-dATP 與 polynucleotide kinase

• T4 polynucleotide kinase（PNK） 把 ATP 的 γ-磷酸 轉移到 DNA/RNA 的 5'-OH 上。
• 欲放射性標記 5' 端，需用 γ-³²P-ATP（或 γ-³²P-dATP）；α、β 位磷酸不會被轉移。

8.9.4　DNase I

• 非專一性 endonuclease：切 磷酸二酯鍵（phosphodiester bond）
• 不切糖苷鍵、不切氫鍵
• 應用：移除汙染 DNA、footprinting、基因體可及性分析（DNase-seq）。

8.9.5　Site-directed mutagenesis（定點突變）

目的：在特定位置製造單鹼基或片段突變。
需要：

• ✅ 突變 primer（攜帶欲插入的突變序列）
• ✅ DNA polymerase（高保真，如 Pfu）
• ✅ dNTPs、模板 DNA
• ❌ 不需 reverse transcriptase（這是 DNA → DNA，不涉及 RNA）

8.9.6　V(D)J 重組（抗體多樣性）

• 輕鏈（κ 或 λ）基因由 V、J、C 多個片段組合生成。
• V 與 J 的重組發生在 DNA 層面（由 RAG1/RAG2 裁切黏合，前 B 細胞 / 前 T 細胞階段）。
• J 與 C 的「重組」其實是 mRNA 剪接（splicing）：在 RNA 層面完成（DNA 上 J 與 C 中間的內含子透過 mRNA splicing 切除）。

國考：「V-J 與 J-C 重組分別發生在什麼層面？」答案 DNA；RNA。

8.9.7　人類基因體幾個常考事實

• 人類基因體約 3 × 10⁹ bp
• 編碼蛋白質的序列僅約 1–2%（不是 40%！，國考常見錯誤選項）
• ~50% 為轉座子/重複序列
• 大部分基因被內含子打斷
• 著絲粒、端粒為特殊功能重複序列

轉座作用（transposition）的核心機轉

典型 DNA 轉座子的兩端帶有末端反向重複序列（terminal inverted repeats, TIR），供轉位酶（transposase）辨識。插入新位置時依序發生：

1. 轉位酶辨識並切開轉座子兩端。
2. 轉位酶在目標 DNA 的兩股造成錯位切口（staggered cuts）。
3. 轉座子末端接上目標 DNA；宿主 DNA polymerase 補平兩側缺口，再由 DNA ligase 接合。
4. 原本只存在一份的目標序列因此在轉座子兩側各出現一份，形成同向的目標位點重複（target-site duplication, TSD）。

最容易混淆：TIR 是轉座子本身兩端、方向相反的序列；TSD 則來自宿主目標 DNA，因錯位切口與缺口補合而形成，位於插入元件兩側且方向相同。

• DNA transposon：多數以切下再貼上（cut-and-paste）方式移動，由轉位酶直接處理 DNA，不經 RNA 中間體。
• Retrotransposon：先轉錄成 RNA，再由反轉錄酶製成新的 DNA 副本並插入基因體，通常屬複製再貼上（copy-and-paste），原位置的拷貝仍保留。

8.9.8　鋅指（zinc finger）與鋅的其他角色

• Zinc finger（鋅指）= 由 Cys 與 His 殘基配位 Zn²⁺，形成 DNA 結合模組；常見於轉錄因子（不是 RNA pol 的主要輔因子，這是國考陷阱）。
• Leucine zipper 則是兩條 α-helix 的白胺酸每 7 個胺基酸重複一個，形成「拉鍊」二聚體（與 Zn 無關）。
• 鋅的其他角色：
  • Gustin（味覺素）：唾液中含鋅蛋白，缺 Zn → 味覺減退
  • ALA dehydratase（heme 合成）：Zn 依賴，鉛中毒以 Pb 取代 Zn → heme 合成受阻（見 Ch06）
  • T 細胞、單核球分泌 cytokine 需要 Zn